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circRNA干扰实验
产品介绍
针对circRNA的接头序列设计siRNA序列特异性敲低目的circRNA的表达，对于每条选定的siRNA靶序列，设计正义链和反义链，以 loop（9nt or 10nt）相连，构建shRNA质粒直接转染或通过病毒包装后转染细胞，并对转染细胞进行阳性鉴定和转代细胞株的培养，最终实现对特定circRNA特异性敲低的作用。
针对circRNA circPAIP2进行siRNA敲低实验示意图
技术优势
1. shRNA载体转染效率高、操作简单、RNA沉默效果易于检测；
2. 设计circRNA Divergent primers检测敲低circRNA的效率；
3. 特异性敲低circRNA的表达，不影响亲本线性基因的表达。
客户提供
1. mRNA/lncRNA需要提供基因名称（ID号）、种属；
2. circRNA需要提供基因名称（ID号）或者完整序列、种属。
交付标准
1. shRNA质粒（3+1套餐，3个无敲低效果，免费加做一个）：10 μg质粒+200 μL甘油菌；
2. 对照质粒：10 μg质粒+200 μL甘油菌；
3. 载体构建报告；
4. 筛选验证报告（细胞转染+qPCR检测）。
结果展示
qPCR检测结果
表1 NNN细胞中has_circ_000XXXX相对表达差异
Sample name | GAPDH Average CT | hsa_circ_000XXXX Average CT | 2-ΔΔCT1 | 2-ΔΔCT2 | 2-ΔΔCT3 | Average 2-ΔΔCT±SD | SEM |
NNN-control | 13.87±0.12 | 25.66±0.09 | 1.07 | 0.98 | 0.96 | 1±0.06 | 0.03 |
NNN-si-NC | 13.9±0.07 | 25.68±0.1 | 1.03 | 1.06 | 0.93 | 1.01±0.07 | 0.04 |
NNN-si-1 | 13.83±0.11 | 26.36±0.08 | 0.56 | 0.6 | 0.63 | 0.6±0.03 | 0.02 |
NNN-si-2 | 13.79±0.16 | 26.53±0.05 | 0.5 | 0.51 | 0.54 | 0.52±0.02 | 0.01 |
NNN-si-3 | 13.84±0.08 | 27.21±0.08 | 0.33 | 0.36 | 0.32 | 0.34±0.02 | 0.01 |
图1 NNN细胞中has_circ_000XXXX相对表达差异
常见问题
1. circRNA 的沉默（干扰）怎么做？
基于RNAi技术对基因进行沉默，实验中一般设计合成靶标基因的siRNA，瞬转细胞后进行RT-PCR检测。
外显子来源的circRNA因为和mRNA有同样的外显子序列，在序列内部设计siRNA靶标无法保证特异性，因此只能针对junction位点处设计靶标序列，前后移动范围有限，siRNA通常很难设计。EiciRNA或者内含子来源的环形RNA，除了针对junction位点处设计靶标外，也可以尝试在内含子序列上设计。
2. 设计siRNA为什么不能连续GC超过3个，连续AT超过4个？
因为连续 3个以上的 G 和 C 可以降低双链 RNA 的内在稳定性，从而抑制 RNAi 作用；连续 4个以上的 U 和 A 可能终止由 RNA Polymerase III 介导的转录。siRNA 序列中的重复序列或回文结构可能形成发夹状结构，这种结构的存在可以降低 siRNA 的有效浓度和沉默效率。