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Fc标签融合蛋白

Fc融合蛋白Fc融合蛋白是指利用基因工程技术将免疫球蛋白(IgG、IgA等)的Fc段与某种具有生物学活性的功能蛋白分子融合而产生的新型蛋白。具有生物学活性的功能蛋白可以是细胞因子、毒素、受体、酶、抗原肽等。Fc融合蛋白不仅可发挥所融合蛋白的生物学活性,还具有一些抗体的性质,如可引起抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒作用( CDC)与抗体依赖细胞介导的吞噬作用(ADCP)等。
蛋白类药物在血浆内半衰期较短,为了达到治疗效果需要大剂量给药,这样会造成严重的副作用,给患者造成巨大的负担。将功能蛋白与免疫球蛋白的Fc段融合,可以延长药物在血浆内的半衰期,降低药物的免疫原性,在疾病的诊断与治疗方面有重要的意义。

Fc融合蛋白结构与功能

Fc融合蛋白由免疫球蛋白的Fc段与具有生物学活性的蛋白分子组成。Fc段与功能蛋白具有相对独立的结构域与功能,能够从不同角度影响融合蛋白的理化性质与生物学活性。

Fc融合蛋白结构

图1:Fc融合蛋白结构

Fc结构域

Fc融合蛋白最主要的特点是包含Fc段,与单克隆抗体中Fc段功能类似,融合蛋白的Fc段可以起到延长功能蛋白在血浆内的半衰期、提高分子的稳定性、特异性结合体内的Fc受体,并发挥相应的生物学功能等作用。除此之外,Fc段可以特异性结合protein A,简化了Fc融合蛋白的纯化步骤,在相关生物制品的研发制备具有重要意义。

延长半衰期

人体内的免疫球蛋白依赖于Fc段与新生Fc受体(FcRn)的结合,在FcRn的保护下,半衰期可以长达19~21d。与此类似,Fc融合蛋白也能依赖此原理延长在体内的半衰期:Fc段与FcRn的结合呈pH依赖性,在pH7.4的生理条件下,FcRn与Fc不结合;在细胞内涵体pH 6.0~6.5的酸性条件下,两者结合,从而避免了融合蛋白在细胞内被溶酶体等快速降解。除此之外,Fc段能够增大分子体积,降低肾清除率,也从一定程度上延长了半衰期。

提高分子稳定性

Fc融合蛋白可以通过Fc铰链区的二硫键链接形成稳定的二聚体。通过对二硫键进行进一步的基因工程改造,还可以使Fc融合蛋白形成更加稳定的六聚体复合物。另外,Fc区域可以独立折叠,保证了分子的稳定性。

有利于融合蛋白的表达与检测

将Fc段与功能蛋白融合,可提高蛋白在哺乳动物中的表达分泌,同时Fc段可以与protein A发生特异性结合,有利于融合蛋白的纯化。

与Fc受体结合,发挥生物学效应

Fc融合蛋白的FC结构域可与免疫细胞表面的Fc受体结合,发挥多种生物学功能(见表1),如介导穿过胎盘和粘膜屏障、炎症反应、抗体依赖细胞介导的吞噬作用(ADCP)、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(CDC),促进树突状细胞(DC)成熟,调节细胞因子分泌,调节B细胞增殖分化等。

表1:主要的Fc受体及相应的生物学功能

受体抗体配基细胞分布配基亲和力(L/mol)效应
FcγRⅠ(CD64)IgG单核细胞、巨噬细胞等107~105噬菌作用,细胞激活,介导ADCC效应
FcγRⅡa(CD32)IgG巨噬细胞、中性粒细胞等<107噬菌作用,脱颗粒作用,介导ADCC效应
FcγRⅡb(CD32)IgGB细胞、单核细胞等<107抑制细胞激活作用
FcγRⅢa(CD16a)IgG巨噬细胞、单核细胞等2×107介导ADCC效应,促巨噬细胞分泌细胞因子
FcγRⅢb(CD16b)IgG中性粒细胞、嗜酸细胞等<107诱导杀菌作用
FcεRⅠIgE肥大细胞、嗜碱细胞等>1010脱颗粒作用,促炎症介质或细胞因子释放
FcεRⅡ(CD23)IgEB细胞、T细胞等106调节作用
FcαRⅠ(CD89)IgA中性粒细胞、单核细胞等2*107噬菌作用,介导ADCC效应
FcRnIgG上皮细胞、内皮细胞2*108将母体IgG转运到胎儿体内;保护IgG免受降解

功能蛋白

Fc融合蛋白的Fc结构域影响了融合蛋白分子的理化性质与生物学活性,而功能蛋白部分则决定了Fc融合蛋白的药理活性。功能蛋白的种类很多,可以是细胞因子、毒素、受体、酶等,其作用也各不相同。功能蛋白的作用主要有:抗炎性感染、抗病毒感染、抗瘤免疫、防止溶骨、抗移植排斥、治疗痛觉过敏、自身免疫性疾病的治疗等。

Fc蛋白的临床应用

大部分Fc融合蛋白药物的作用机制为受体与配体之间的相互作用,同时辅以Fc片段的多种生物学功能。截止2014年9月,已有9种人IgG-Fc融合蛋白药物经美国食品及药品监督管理局(FDA)批准临床使用,包括治疗甲型血友病药物抗血友病因子Fc融合蛋白(Eloctate,2014)、移植排斥药物Belatacept(Nulojix,2011)、乙型血友病的药物凝血因子IXFc融合蛋白(Alprolix,2014)、年龄相关性黄斑变性药物Aflibercept(Eylea,2011)、CAPS药物Rilonacept(Arcalyst,2008)、慢性免疫性血小板减少性紫癜药物Romiplostim(Nplate,2008)、风湿性关节炎药物Abatacept(Orencia,2005)和Etanercept(Enbrel,1998)以及银屑病和移植排斥药物Alefacept(Amevive,2003)。除了上述已成功转化的临床应用的Fc融合蛋白外,有更多的Fc融合蛋白药物处于临床研究中 。

另外,Fc融合蛋白也可以作为一种新型疫苗形式,将病原体的部分抗原肽与IgG-Fc片段进行融合,诱导机体产生抗原特异性免疫应答。研究表明,HIV-1 Gag p24、gp120 V3以及流感病毒HA胞外域与小鼠IgG2a-Fc的融合疫苗,可提高小鼠抗原特异性体液免疫反应。

Fc融合蛋白较传统蛋白类药物具有多种新特性,在全世界范围内受到广泛关注,但Fc融合蛋白本身也存在许多局限,如价格昂贵、不可口服给药等。随着相关技术与理念的不断进步,Fc融合蛋白在临床治疗、医学生物研究等领域必将发挥更大的作用。

附带 解析ProteinA与G

提到Protein A和Protein G,相信大家并不陌生,由于它们和抗体的特异性亲和作用,所以可用于纯化抗体,免疫共沉淀实验等,其应用非常广泛,本期小编带大家仔细的认识一下Protein A和G,两者的区别以及如何从中选择。

1. Protein  A

20世纪中期,Jensen发现有一种蛋白可以与人和兔血清抗体广泛结合,该蛋白于1964年首次被称为Protein A。  Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质,分子量42KD,它能够特异性地结合多种免疫球蛋白的Fc区段而与Fab区或轻链结合很弱。天然的Protein A有5个IgG结合结构域和未知功能的非Fc结合域,结构示意图如下:

此结构的蛋白A大量结合IgG的同时,其非Fc结合域能结合部分杂蛋白,导致洗脱下来的IgG纯度不够,因此科学家利用基因工程的方法克隆Protein A的基因并进行改造,得到重组型蛋白A,其非特异性结合明显降低。重组的蛋白A经过改造后有一个C端的半胱氨酸,可以单点偶联到琼脂糖上,降低空间位阻的同时提高IgG的结合能力。一步亲和层析后样品纯度可超过90%。

2. Protein G

蛋白G来自于链球菌G族的细胞表面蛋白,是III型Fc受体,分子量为25KD,其通过类似于蛋白A的非免疫机制而结合抗体的Fc段,蛋白G与蛋白A均可结合抗体的Fc段,不同的是,蛋白G还能结合Fab段,且蛋白G可以更广泛的结合更多类型的IgG分子,多克隆IgG分子,同时蛋白G与血清蛋白结合水平低,产物纯度高,且配基脱落更低。抗体基本结构和蛋白A/G的结合位点如下图所示:

蛋白G可以纯化不能与蛋白A结合的哺乳动物抗体。重组型的蛋白G经改造后已经去除了白蛋白结合位点(血清白蛋白是抗体来源的主要污染物)及细胞表面结合位点,减少了非特异性结合。

3. Protein A 和G亲和力对比

蛋白A和蛋白G对于不同种属和不同亚型的抗体结合能力差异如下表所示,蛋白A对兔来源抗体的亲和力较高,蛋白G对于小鼠等部分哺乳动物抗体的亲和力较高。

 

现在对于蛋白A和蛋白G,您是否有了更深入的认识呢?其实我们还有多种抗体亲和材料供选,适合于捕捉各种抗体片段的CaptoL,以及有更好耐碱性的MabSelect SuRe,以及高载量高性能的MabSelect PrismA。



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