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当前位置: 首页>分子生物产品>质粒快速扩增系统

 

质粒快速扩增系统(phi29升级版)

 

Plasmid Rapid Amplification Kit


RPK-02100


本产品是一种利用随机引物和细菌复制系统扩增DNA的试剂盒灵敏度极高,可以在1-2小时内将1pg-1ng质粒DNA扩增到μg级以

上,或者1-3小时内将0.001-0.5 μl菌液OD1.0)中质粒扩增至μg级。试剂盒使用的DNA复制系统具有35核酸外切酶活

性,保真性非常高,突变率比taq酶低3000倍以上。

该试剂盒制备的质粒DNA经单,双酶切后的产物和常规质粒酶切后的产物相同,可用于下一步连接反应。适用于质粒的亚克隆,

转录模板DNA的制备,一代测序质粒模板制备等。

 

试剂盒成分100

Component

Volume

PRA Buffer10 X

200 uL

PRA Substrate5 X

400 uL

PRA Enzyme

100 uL

 

操作步骤:

1质粒扩增

使用新鲜菌液效果比较好,不要使用冻存时间过长的表达菌比如BL21扩增质粒

 

      反应体系(20uL

成分

体积(uL

菌液(OD1)或质粒(≤1ng

0.1-1

PRA Buffer10 X

2

PRA Substrate5 X

4

ddH2O

加至总体积19uL

 

95加热3分钟(95加热时间过长会产生非特异性扩增,),取出后放冰上或者直接4000-8000g离心 1分钟,待冷却至室温以

下后,加入1 μL酶,42反应1-3小时。反应结束后,70加热灭活10分钟。

(2)扩增质粒检测

以下两种方案可选

1. 限制性内切酶切扩增质粒

配制限制性内切酶反应体系,加入1/5体积上述质粒扩增产物,酶切30-60分钟。扩增质粒片段可以通过琼脂糖凝胶电泳检测。

本试剂盒buffer兼容大部分NEB公司HF系列内切酶以及Fermentas公司快速内切酶可以直接在反应体系中加上述酶,除此之

外的内切酶需要使用相应的buffer按上述操作将扩增产物稀释5

酶切后产物片段和使用环状质粒酶切后产生片段完全一样。可以通过琼脂糖凝胶电泳切胶回收。

 

2. 制备一代测序模板

第一步产物中加入2U碱性磷酸酶,37反应30分钟,95 3分钟灭活。取2-6 μL 反应液作为测序模板。

质粒扩增案例:

图片1.png 

案例1:不同质粒在42扩增1或者2小时后,使用限制性内切酶单酶切后电泳图。

12p011 T-vector, 16: PBI-CMV; 19: pET28a; 20: pIRES2-EGFP; 17: pACYC-dut1;14: pGL4.29; 18: pCAG; 15: pCOLD-I.

 

图片2.png 

案例2:从不同浓度T载体质粒或含载体菌液中扩增质粒,12小时后单酶切检测扩增产物。1-6分别是T载体质粒1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 0.1 pg, 0.01 pg作为模板。7-12分别是OD1.0的含T载体的Trans1T1菌液稀释110100100010000100000倍后取1 μl做模板。

 

 图片3.png

案例3:含pmal-c5x质粒的菌液使用本试剂盒42扩增2小时后,加入2 U碱性磷酸酶37反应30分钟,95 3分钟灭活。取6 μL 反应液作为测序模板,使用malE引物测序结果。

 

品牌货号品名规格报价折后价终端
GeneraybioRPR-01Plasmid Rapid Amplification Kit25次300240
GeneraybioRPR-02Plasmid Rapid Amplification Kit100次900720
GeneraybioRKP-012ⅹ HG PCR mix1mL600450
GeneraybioPKP-022ⅹ HG PCR mix5*1mL22001650


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